• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
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  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:
    Die Erfindung besteht im Anschluss eines Hohlfasersegmentes an das Ende einer Fließstrecke für die Flüssig-Chromatographie. Das Hohlfasersegment kann je nach der Größe der zu trennenden Stoffe für Umkehrosmose, Nanofiltration, Ultrafiltration oder Mikrofiltration ausgelegt sein. Mehrere Hohlfasersegmente können erfindungsgemäß in Verbindung mit einem Mehrkanalschalter oder in Verbindung mit zeitlich parallel laufenden Säulen zum Sammeln chromatographisch getrennter Stoffe eingesetzt werden. Besonders vorteilhaft ist die Erfindung für die Chromatographie von polymeren Stoffen, die für anschließende Analysen nach der Elution von der Säule in konzentrierter Form und in einem bestimmten Medium vorliegen müssen.
    公开号:DE102004030878A1
    申请号:DE200410030878
    申请日:2004-06-25
    公开日:2006-01-19
    发明作者:
    申请人:Dr Lerche KG；
    IPC主号:G01N30-84
    专利说明:
    [0001] Beizahlreichen präparativenund analytischen Anwendungen der Flüssigchromatographie kann dasSammeln der eluierten Substanzen erforderlich sein. Dies ist beider Analytik insbesondere dann der Fall, wenn die an den Detektorenerfassten Peaks chemisch nicht identifiziert sind oder mehrere Stoffeenthalten, die mit einem zusätzlichenTrennverfahren analysiert werden müssen. Obwohl für die automatischeAufteilung des Eluatstromes kommerzielle Fraktionssammler zur Verfügung stehen,wird die Folge-Analytik häufigdadurch erschwert, dass der chromotographische Trennprozess mitVerdünnungverbunden ist oder dass die zur Elution verwendeten gelösten Substanzenstörendwirken. Hierdurch könnenSubstanzverluste entstehen, die den Einsatz größerer Säulen oder einen höheren Aufwandbei der Probenvorbereitung erforderlich machen.
    [0002] Ausdiesen grundsätzlichentechnischen Problemen ergibt sich als Aufgabe der Erfindung die Bereitstellungeiner Vorrichtung, die das Sammeln der eluierten Zielsubstanz mitder Abtrennung des flüssigenElutionsmittels und dem Aufkonzentrieren verbindet.
    [0003] DieAufgabe wird durch ein Verfahren und eine Vorrichtung, die in denunabhängigenAnsprüchen1 und 5 dargestellt sind, gelöst.Vorteilhafte Ausführungendes Verfahrens und der Vorrichtung sind Gegenstand abhängiger Unteransprüche.
    [0004] DemVerfahren liegt der Gedanke zugrunde, die aus der Säule austretendenFlüssigkeitsportionen,welche die interessierende Substanz enthalten, in ein Hohlfasersegmentund nachfolgend durch dessen Membran zu leiten. Durch den Anschlusseines verschlossenen Hohlfasersegmentes an die chromatographischeFließstreckegelingt es so bei richtiger Wahl der Größenausschlussgrenze der Hohlfasermembran,beim Sammeln der chromatographisch abgetrennten Substanz das Elutionsmittelund gegebenenfalls weitere permeable Stoffe von der interessierendenSubstanz zu trennen und letztere zu konzentrieren. Besonders vorteilhaftist die Vorrichtung fürdie chromatographische Isolation von Polymeren, weil in diesem Fallein zusätzlicherReinigungsprozess, nämlichdie Abtrennung etwa noch vorhandener niedermolekularer Begleitstoffe,mit dem Konzentrationsprozess kombiniert werden kann. Entweder wirdder Eluatstrom aus einer Säulemit Hilfe eines Mehrkanalschalters portioniert und in einer bestimmtenReihenfolge durch die Membran von mehreren Hohlfasersegmenten geleitet,oder eine definierte Portion des Eluatstromes, der das Zielproduktenthält,wird durch die Membran eines Hohlfasersegmentes bewegt. Im Allgemeinenwird das Lumen der Hohlfaser zum Sammeln genutzt. Die erfindungsgemäße Vorrichtungkombiniert die hohe Druckbelastbarkeit, die hohe Volumenflussleitfähigkeitund die günstigeOberflächen/Volumen-Relationkommerzieller Hohlfasern fürdie Umkehr-Osmose, die Nanofiltration, Ultrafiltration oder dieMikrofiltration mit den leistungsfähigen Pumpsystemen und Trennverfahren modernerChromatographie-Geräte.
    [0005] Esist vorteilhaft, dass die stark aufkonzentrierte Substanz verlustfreiund bequem aus dem Hohlfaserlumen entnommen und sofort für ein weiteresTrennverfahren in konzentrierter Form eingesetzt werden kann. Wirdbeispielsweise Elektrophorese oder Elektrofokussierung angeschlossen,könnenIonen oder andere störendeSubstanzen bequem entfernt oder ausgetauscht werden. Hierzu wirddas beidseitig verschlossene Hohlfasersegment mit der für die Trennungoptimalen Flüssigkeitgewaschen.
    [0006] DieHohlfasersegmente könnenentweder in trockener, gasgefüllterForm an die Fließstreckeangeschlossen werden, oder sie sind bereits vor dem Einstrom desEluates mit Flüssigkeitgefüllt.Bei einem kontinuierlichen Elutionsprozess kann eine Fraktionierungdes Eluates mit Hilfe eines Mehrkanalschalter geschehen. Bei diskontinuierlicherElution ist es vorteilhaft, nur den Teil der eluierten Flüssigkeit,der die Zielsubstanz enthält,durch die Hohlfasermembran zu leiten. Um den Sammel- und Konzentrierungsvorgangzu starten, wird das Eluat in eine Fließstrecke gelenkt, die durchdie semipermeable Membran des Hohlfasersegmentes führt. Dies kanndurch den Anschluss des bereits verschlossenen Hohlfasersegmsegmentesan die Fließstrecke oderdurch Anbringen eines Verschlusses an ein offenes Hohlfasersegment,das sich in der Fließstrecke befindet,erfolgen.
    [0007] Wirdder wasserhaltige Eluatstrom in eine bereits an ihrem Ablauf verschlossenehydrophile Hohlfaser geleitet, ist es von Bedeutung, dass eingeschlossenesGas vollständigverdrängtwerden kann. Erfindungsgemäß dienthierzu ein gasdurchlässiger Verschluss,der eine hydrophobe, poröseMembran enthält.
    [0008] Ineiner erfindungsgemäßen Varianteder Vorrichtung werden die Hohlfasersegmente als Sammelgefäße in einenFraktionssammler integriert. Hierdurch entsteht ein Fraktionssammler,der konzentrierend und selektierend wirkt. Sein Konstruktionsprinzipbesteht in der druckfesten, dichten und schaltbaren Verbindung derdem Säulenausgang nachgeschaltetenFließsstreckemit mehreren Hohfasersegmenten. Es wird beispielsweise durch einen elektronischgesteuerten Vielkanalschalter realisiert. Ein Vorteil dieses Fraktionssammlersbesteht neben der Selektion der unpermeablen Eluatbestandteile undder konzentrierenden Wirkung auch in einem geringen Gewicht undeinem geringen Platzbedarf.
    [0009] Ineiner weiteren Variante der Vorrichtung werden die Hohlfasersegmentemit Chromatographiesäulenfür dieAusschlusschromatographie verbunden, um nur eine Eluatfraktion miteinem Zielprodukt, beispielsweise die im Ausschlussvolumen eluierteDNA, in konzentrierter Form zu sammeln. Für derartige und zahlreicheweitere Anwendungen in der Analytik und Probenvorbereitung können bekannteVorrichtungen zum Parallelbetrieb mehrerer gleichartiger Säulen eingesetztwerden. In diesen Vorrichtungen werden gleichzeitig durch jedesBett gleiche Portionen einer Flüssigphasemit der gleichen Kraft bewegt. Entsprechende Zentrifugations- undSaugvorrichtungen werden seit langem für den Parallelsäulenbetriebin chromatographischen Verfahren eingesetzt. Sie eignen sich inder bisher bekannten Form vor allem für hochselektive Trennprozesse,bei denen ein Sorptionsvorgang, ein Waschvorgang und ein Desorptionsvorgangaufeinander folgen. Bei diesen Trennprozessen spielt die Effizienz(Trennstufenhöhe,Trennstufenzahl) keine Rolle und es kommt nicht darauf an, einzelneEluatportionen abzutrennen.
    [0010] Esist vorteilhaft, wenn beim Parallelbetrieb mehrer Chromatographiesäulen injeder Säulenur der Teil des Elutionsmittelflusses durch die Hohlfasermembrangeführtwird, der die Zielsubstanz enthält.Erfindungsgemäß wird derFluss durch jede Säuleautomatisch auf Grund der Kapillarspannung des Elutionsmittels imfeinporigen oberen Abschluss jedes Bettes unterbrochen, nachdemdie Probeflüssigkeitoder eine bestimmte Portion des Elutionsmittels vollständig indas Bett eingeströmtist. Dies ermöglichtes, parallel in zahlreichen Säulendie gleichen Volumenfraktionen durch das Bett zu bewegen, auch wenndie Fließgeschwindigkeitin den einzelnen Säulenvariiert. Zum parallelen Sammeln und Aufkonzentrieren der Zielsubstanzwird ein definiertes Elutionsmittelvolumen auf das Bett geschichtetund danach eine ebenso großedefinierte Portion des Eluatstromes durch die Hohlfasermembran gelenkt.Die dargestellten Verfahren und Vorrichtungen erweitern den Anwendungsbereichder bekannten Vorrichtungen zum Parallelsäulenbetrieb. Sie ermöglichendas parallele selektive und konzentrierende Sammeln chromatographischgetrennter unpermeabler Stoffe aus einer eng begrenzten Volumenfraktiondes Eluatstromes. Dies ermöglichtdie Nutzung der Vorrichtungen zum Parallelbetrieb zahlreicher Chromatographiesäulen auchzur Durchführungsolcher Verfahren wie der Größenausschlusschromatographieoder der Umkehrphasenchromatographie, in denen eine hohe Trennstufenzahlausgenutzt werden kann.
    [0011] DieErfindung wird im folgenden an Hand von Anwendungsbeispielen erläutert. 1. Die Erfindung wird zur Bereitstellung einesselektiv und konzentrierend wirkenden Fraktionssammlers eingesetzt.Ein Vielkanalschalter mit 20 Schalterstellungen ist über 20 Kapillarenund ebenso viele Ansatzstückedruckdicht mit Hohlfasersegmenten verbunden. Er wird mit seinemEingang an den Detektorausgang einer HPLC-Anlage angeschlossen.Es werden beispielsweise Proteine durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographiegetrennt. Die Hohlfasersegmente wurden aus einer kommerziellen Ultrafiltrationsfasermit hoher Permeabilitätfür Salzlösungen undeiner Molmassenausschlussgrenze von ca. 10 kDa hergestellt und sinddurch einen nadelförmigenTeflonstopfen verschlossen. Jedes Segment wird nach aussen durchein offenes mit FlüssigkeitgefülltesRohr aus Acrylglas vor dem Austrocknen geschützt. Unten sind die Rohre miteinem gemeinsamen Abfluss verbunden. Der Abfluss führt in einenSiphon, der verhindert, dass die Flüssigkeit aus den Acrylglasrohrenvollständigausläuft.Der Vielkanalschalter wird manuell oder in geeigneter Weise automatisch,z.B. mit Hilfe eines Schrittmotors betätigt. So ist es möglich, denEluatfluss zeitgesteuert in festgelegter Reihenfolge oder in Abhängigkeitvon der Detektion durch unterschiedliche Hohlfasersegmente zu bewegen.Nach dem Abschluss der Elution werden die Hohlfasersegmente nacheinandervon den Anschlusskapillaren getrennt und an ihrem Ansatzstück aus denAcrylglasröhrenherausgezogen. Zur Identifizierung der in den Hohlfasersegmentengesammelten Proteine sollen Verfahren angeschlossen werden, beidenen die hohe Salzkonzentration des Elutionsmittels stört, z.B. Gelelektrophereseoder Elektrofokussierung. Daher wird das Hohlfasersegment vor derEntnahme der aufkonzentrierten Proteinfraktion am oberen Ansatzstück durcheinen passenden Stopfen verschlossen und mit dem Elektrophorese-Puffer odermit einer verdünntenNeutralsalzlösunggewaschen. Um die Entnahme der Proteinlösung zu erleichtern, ist dasAnsatzstückso beschaffen, dass es auf eine kommerzielle Pipettenspitze aufgestecktwerden kann. Die Entnahme kann so vor sich gehen, dass der Stopfennach dem Ansetzen der Kolbenhubpipette abgenommen wird, und der Inhaltdes Hohlfasersegmentes in ein Röhrchen ausgepresstwird. Alternativ kann die Pipette in der Saugposition angesetztwerden. Nach dem Herausziehen des Stopfens strömt die Proteinlösung indie Pipettenspitze. 2. Die Erfindung wird zur Isolation konzentrierter, reiner DNAaus einem proteinhaltigen Rohextrakt durch Größenausschlusschromatographieeingesetzt.
    [0012] Eine4 ml fassende, nach unten konisch verengten Säule aus Polypropylen endetunten in einem kapillaren Ausgang, der von einer kreisförmigen Filterplatteaus porösemPolypropylen mit einem Durchmesser von 3 mm abgedeckt ist. Auf diesesFilter wird ein 60 mm hohes Bett aus Sporopollenin-Mikrokapselnentsprechend WO 03/078048 geschichtet. Eine 100 mm lange Ultrafiltrationsfaserder Firma Membrana GmbH aus Polyethersulfon mit einem Außendurchmesser1 mm, einem Lumendurchmesser 0.7 mm und einer nominellen Ausschlussgrenzefür Proteinevon 70 kDa ist mit Hilfe einer Silikongummi-Dichtung in einen Kunststoff-Adaptereingedichtet. Mit Hilfe des konischen Adapters wird das Hohlfasersegmentan die konisch verengte Säuleangeschlossen. Das Bett wird oben durch eine 2 mm dicke Schichtaus Glaskugeln mit einem Durchmesser von ca. 5 μm abgeschlossen. Das Bettvolumenbeträgt 1,5ml. Die Mikrokapseln sind fürProteine und andere Polymere bis zu einem Stokesschen Radius von ca.50 nm hoch permeabel. DNA und andere extrem große Makromoleküle mit einemStokesschen Radius über100 nm werden dagegen vollständigausgeschlossen. Zum Transport der Flüssigphase wird die konischeSäule mitdem angeschlossenen Hohlfasersegment in die passende Bohrung einesSilikongummistopfens, der sich auf einer Saugflasche befindet, eingebracht.Wird Wasser oder eine wässrigeLösungmit dem Unterdruck von 0,6 bar durch die Säule gesaugt, kommt der Flusszum Stehen, nachdem die aufgetragene Flüssigkeit vollständig indas Bett gesaugt wurde, weil die Adhäsion des Wassers und seineOberflächenspannungin den feinen hydrophilen Poren zwischen den Glaskugeln den Durchtrittvon Luft durch diese Schicht verhindert.
    [0013] ZurReinigen und zum Aufkonzentrieren der DNA aus dem Rohextrakt werdennacheinander folgende Arbeitsschritte durchgeführt. 1. Waschen der Säule mit2 ml der als Elutionsmittel dienenden wässrigen Lösung (50 mM Ammoniumhydrogencarbonat), 2.Verschließender Hohlfaser mit einer passenden Nadel aus Teflon, 3. Auftragenund Einsaugen von 0,1 ml eines proteinhaltigen partikelfreien Rohextraktes,4. Auftragen und Einsaugen von 0,6 ml des Elutionsmittels. Das Verschließen derHohlfaser führt dazu,dass das Eluat durch die Membran strömen muss. Dabei bleibt dieFließgeschwindigkeitunverändert,weil die hydraulische Leitfähigkeitdes chromatographischen Bettes weit unter der hydraulischen Leitfähigkeitder Hohlfaser liegt. Hochmolekulare DNA, die nicht in die Mikrokapselndiffundiert, wird mit einem relativen Elutionsvolumen von 0,3 bis0,4 eluiert und befindet sich nach dem 4. Arbeitsschritt in demHohlfasersegment. Das bisher aufgetragene Volumen reicht jedochfür dieElution der Proteine und der Komponenten des Lysepuffers nicht aus,da diese Stoffe durch den Austausch mit dem Lumen der Mikrokapselnverzögertwerden. Die konzentrierte Lösungder gereinigten DNA wird mit Hilfe einer an den Adaptor passendenKolbenpipette in das Analysengefäß abgepresst.Die hohe Reinheit und der isolierten DNA wird durch das hohe Verhältnis derExtinktionen E250/E280 (> 1,7) belegt. Die Anwendungder erfindungsgemäßen Vorrichtunghat in Verbindung mit der ausschlusschromatographischen Wirkung derSporopollenin-Mikrokapseln den Vorteil, dass das Zielprodukt, hierbestehend aus extrem großen DNA-Molekülen, ingereinigter und gleichzeitig konzentrierter Form vorliegt. Außerdem istvorteilhaft, dass die Flüssigkeit,in der die DNA in der Hohlfaser gelöst ist, in Abhängigkeitvon der anschließenden analytischenoder präparativenVerwendung (z.B. PCR, Pulsfeldelektrophorese, e.t.c.) bestimmt werdenkann. Dies kann entweder durch die Wahl des vor der Probe aufgetragenenLaufmittels oder nachträglichdurch Einlegen des beidseitig verschlossenen Hohlfasersegmentesin die gewünschteLösung geschehen.Enthältder Rohextrakt außerProteinen z.B. hochmolekulare RNA, kann eine kleine Menge einesRNAse-haltiger Elutionspuffer vor der Probe auf die Säule aufgetragenwerden. Hochmolekulare RNA, die ohne diese Maßnahme gemeinsam mit der DNAeluiert würde,kommt auf diese Weise in Kontakt mit dem hydrolytisch wirkendenhochaktiven Enzym, wird gespalten und gemeinsam mit den Proteinen eluiert. 3. Die Erfindung wird in einer Saugvorrichtung zumParallelbetrieb mehrerer Säuleneingesetzt, um ein abgetrenntes Protein selektiv zu sammeln undzu konzentrieren. Es werden Hohlfasersegmene für die Ultrafiltration mit einerLänge von10 cm, einem Außendurchmesservon 1 mm und einem Lumendurchmesser von 0,6 mm verwendet. Sie sindin einen Silikongummi-Adapter eingeklebt. Das Molmassen-Cut-offfür Proteinebeträgt ca.10 000 Da. Fürjedes der Hohlfasersegmente ist für den Verschluss des Ablaufeseine Teflon-Nadelvorgesehen. Jedes Hohlfasersegment wird mit Hilfe des Adapters dichtan den Ausgang einer 5-ml-Einwegspritze angeschlossen, die ein gequollenes1-ml Bett- aus Superdex 200 HR enthält. Das Bett ist oben mit einerfeuchten Zellulose-Mikrofiltrationsmembranabgeschlossen. Letztere bildet eine Gasdurchbruchsbarriere bei Druckdiffeenzenunter 1 bar. Zwölfderartige Chromatographie-Säulenmit angeschlossenen Hohlfasersegmenten werden an eine käuflicheSaugvorrichtung zum Parallelbetrieb von Chromatographiesäulen angeschlossen.Der Auslauf der Hohlfasern ist zunächst offen.
    [0014] DieVorrichtung wird eingesetzt, um den Gehalt verschiedener gepufferterExtrakte an α-Glucose-bindenderLektinen (Kohlenhydrate-bindende Proteine) quantitativ zu ermitteln.Der pH-Wert und die Elektrolytzusammensetzung des Bindungspuffersermöglichendie Bindung der Lektine an die terminalen, in α-1/6-Bindung vorliegenden Glukosemoleküle des Dextrans,das in den Superdex-Partikeln in vernetzter Form vorliegt. Zunächst werden3 ml des Puffers, danach 3 ml jeden Extraktes durch die Säulen bewegt.Jedes Bett wird anschließendmit 3 ml des Bindungspuffers gewaschen und so von den nicht bindendenProteinen befreit. Nun wird jede Säule aus der Dichtung herausgenommen,der Hohlfaserausgang wird verschlossen, und die Säulen werdenwieder in die Saugvorrichtung eingepasst. Anschließend werdendurch jedes Bett 3 ml eines zur Desorption des Lektins geeignetenmaltosehaltigen Puffers und zuletzt 3 ml entionisierten Wassersgewaschen. Befanden sich Lektinmoleküle mit der gesuchten Spezifität in demExtrakt, wurden diese nun in gereinigter und konzentrierter Formin der an diese Säuleangeschlossenen Ultrafiltrationsfaser vor. Nachdem der Adapter vonder Spritze genommen wurde, kann der Inhalt des Faserlumens mitgeringem Luftdruck in ein Probenröhrchen entleert werden.
    [0015] DieSaugvorrichtung fürden Parallelbetrieb mehrerer Säulenkann in Verbindung mit der erfindungsgemäßen Sammelvorrichtung und demerfindungsgemäßen feinporigenAbschluss des chromatographischen Bettes für die parallele Durchführung verschiedensterchromatographischen Prozesse eingesetzt werden. In allen Fällen erleichtertdie Ventilwirkung der feinporigen Membran oder der feinporigen Schichtdas parallele Handling der Säulen,da in allen Säulender Flüssigkeitsstromnach dem vollständigenEinsaugen der auf diese Membran oder Schicht aufgetragenen Flüssigkeitsportionbeendet wird.
    [0016] Imdargestellten Beispiel wird der Eluatstrom vor der Elution des Lektinsaxial durch die Hohlfaser geleitet. Erst bei der spezifischen Elutiondes Lektins mit Hilfe des Zuckerliganden wird das Hohlfasersegmentunten verschlossen, wodurch das eluierte Lektin konzentriert undvom Überschussdes Elutionsmittels befreit wird. 4. Die Saugvorrichtungzum Parallelbetrieb wird fürdie chromatographischen Reinigung von DNA durch Ausschlusschromatographieeingesetzt. Dabei kommen Säulenzum Einsatz, die bereits unter 1. beschreiben wurden. An die Säulen wird vordem Auftragen des proteinhaltigen Rohextraktes ein am Ende verschlossenesHohlfasersegment mit Hilfe des Adapters angeschlossen. Damit beimEinströmendes Eluates die Luft aus dem Hohlfasersegment entweichen kann, besitztdas Hohlfasersegment an seinem unteren Ende einen gasdurchlässigen,für wässrige Lösungen undurchlässiger Verschluss.Der Verschluss besteht aus einer 10-μl-Pipettenspitze aus Polypropylen mitkapillarem Ausgang, in den das einseitig verschlossene Segment einerfeinporigen Hohlfaser aus Polypropylen (Typ Accurel PP 50/280, Firma MembranaGmbH, Wuppertal) mit einem Außendurchmesservon 0,280 mm eingeklebt wurde. Die konische verjüngte Pipettenspitze endet nun indem verschlossenen Polypropylen-Membranschlauch. Sie wird als Stopfenin das Hohlfasersegment eingeführtund bildet einen gasdurchlässigenVerschluss fürdie Flüssigkeitsbewegung. Nachder Elution der DNA wird das Hohlfasersegment von den Säulen abgenommenund die konzentrierte und gereinigte DNA-Lösung mit Hilfe einer an dengasdurchlässigenVerschluss passenden Kolbenpipette verlustarm in ein Gefäß oder eineweitere Trennvorrichtung abgepresst. 5. Die Erfindung wird in einer Zentrifugationsvorrichtung zumParallelbetrieb mehrerer Säuleneingesetzt.
    [0017] AmSwing-out-Rotor einer programmierbaren Zentrifuge befinden sichin den Metallbechern des Rotors zylindrische Kunststoff-Einsätze miteinem Außendurchmesservon 100 mm. Jeder Einsatz besteht aus zwei zylindrischen Teilen,die genau in den Metallbecher passen und in diesem aufeianandergestellt werden können.Das Unterteil hat die Form eines Bechers. Es ist 50 cm hoch, besitzteine 8 mm starke Wand und einen 5 mm starken Boden. Das obere Teilist auf einer kreisrunden 30 mm starken Platte 1 aufgebaut. In dieserPlatte befinden sich radiärsymmetrischangeordnete 20 mm tiefe Bohrungen, welche als Halterung für die Säulen dienen.Als Säulendienen Einwegspritzen mit konischem exzentrischem Ausgang. JedeBohrung besitzt zwei exzentrische Abflusskanäle, in welche der Ausgang der Säulen eingestecktwerden kann. Außerdembesitzt das Oberteil drei 40 mm lange Füße, die 10 mm von seinem äußeren Randbefestigt sind und einen zentral gelegenen Griff, mit dem es imauf das Unterteil gesetzt werden und wieder herausgenommen werdenkann. Sowohl das Unterteil als auch das Oberteil des Kunststoffeinsatzesbesitzen am Rand eine 1 mm tiefe und 1 mm starke axiale Kerbe, diedem Druckausgleich beim Einsetzen in den Metallbecher oder beimHerausnehmen aus dem Metallbecher dient. Einer der Abflusskanäle führt über einen Schraubadapterin das 30 mm langes unten verschlossenes Segment einer UltrafiltrationsfaserDer Außendurchmesserder Ultrafiltrationsfaser beträgt2 mm, der Innendurchmesser 1 mm. Die Säulen können in zwei Positionen indie Halterung eingesetzt werden. In einer Position ist der Ausgangder Säule mitdem offenen Abfluss, in der anderen mit dem unten verschlossenenHohlfasersegment verbunden. Jede Säule enthält unten ein chromatographisches auseinem feinkörnigen,druckfesten Trennmaterial fürdie Reinigung von Proteinen oder Polymeren durch Ionenaustausch-Chromatographie.Das Bett ist oben durch eine hydrophile Mikrofiltermembran abgeschlossen.Das überdem Bett liegende Säulenvolumendient der Aufnahme der Flüssigkeit,die durch das Bett bewegt werden soll. Die feinporige hydrophileMembran verhindert das Eindringen von Luft in das Bett. Um das Trockenlaufender Säulenzu vermeiden, wird darauf geachtet, dass die Zentrifugalbeschleunigungeinen kritischen Wert nicht überschreitet.Bei einer Gasdurchbruchsspannung der Membran von 1 bar darf beispielsweiseauf Grund der 70 mm langen Strecke zwischen der Bettoberkante und demEnde der Hohlfaser bei einer Elutionsmitteldichte von 1,1 die Zentrifugalbeschleunigungden Wert von 900 xg nicht überschreiten.
    [0018] MitHilfe dieser Vorrichtung ist es möglich, die für das Abtrennenund Aufkonzentrieren eines Proteins erforderlichen Elutionsschritteparallel in zahlreichen Säulenvorzunehmen. Zum Waschen der chromatographischen Betten, zu ihrerSättigungmit dem gewünschtenLaufmittel, zum Auftragen der Probeflüssigkeit und Elution von Substanzen,die vor der Zielsubstanz das Bett verlassen, wird das Eluat am Hohlfasersegmentvorbeigeführt.Anschließend werdendie Säulenin die Position gesteckt, in welcher das Eluat durch die Hohlfasermembranströmt. Nachdem anschließendenZentrifugationsschritt wird das Oberteil aus dem Metallbecher herausgenommenund die Hohlfasersegmente werden abgenommen, um das gereinigte undkonzentrierte Protein zu entnehmen. Falls das Elutionsmittel vollständig entferntoder ausgetauscht werden soll, könnendie Hohlfasersegmente beidseitig verschlossen werden, um das Elutionsmitteldurch Dialyse zu entfernen. Es kann auch vorteilhaft sein, die mitdem Zielprodukt beladenen Hohlfasersegmente zu lyophilisieren oder inEthanol zu fixieren.
    权利要求:
    Claims (19)
    [1] Verfahren zum selektiven Sammeln und zum Konzentrierensäulenchromatographischgetrennter Stoffe, dadurch gekennzeichnet, dass eine Volumenportionder aus einer Chromatographie-Säule austretendenFlüssigkeitdurch die Membran eines Hohlfasersegmentes geführt wird und hierbei eine gelöste Substanzim Lumen der Hohlfaser oder in einem die Hohlfaser umgebenden Raumkonzentriert wird.
    [2] Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,dass nacheinander mehrere definierte Volumenportionen der aus derSäule austretenden Flüssigkeitmit Hilfe eines Vielkanalschalters durch die Membranen unterschiedlicherHohlfasersegmente geleitet werden.
    [3] Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,dass ein aus feinen hydrophilen Partikeln bestehendes chromatographischesBett oder ein durch eine feinporige Trennschicht abgeschlossenes Bettund ein adhärierendesElutionsmittel verwendet wird und auf das Bett oder die Trennschichtdie flüssigeProbe und die Elutionsflüssigkeitportionsweise aufgegeben werden, wobei die hierfür eingesetzte Druckdifferenzunter dem Gaseintrittsdruck des Bettes oder der Trennschicht liegt,jede aufgegebene Volumenportion vollständig in das Bett eindringtund die durch die Hohlfasermembran geleitete Volumenportion durcheine oder mehrere der aufgegebenen Volumenportionen bestimmt wird.
    [4] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem ein zuvordurchströmtesHohlfasersegment an seinem Ausgang verschlossen wird, um das flüssige Elutionsmitteldurch die Membran eines Hohlfasersegmentes zu leiten.
    [5] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem ein bereitsan seinem Ausgang verschlossenes Hohlfasersegment mit dem Säulenausgangverbunden wird, um das flüssigeElutionsmittel durch die Membran des Hohlfasersegmentes zu leiten.
    [6] Vorrichtung zum selektiven Sammeln und Konzentriereneluierter Substanzen bei der Säulenchromatographie,dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein einseitig verschlossenesoder einseitig verschließbaresHohlfasersegment mit semipermeabler Membran umfasst.
    [7] Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,dass am offenen Ende des Hohlfasersegmentes ein Anschlussstück zur Herstellungeiner dichten und lösbarenSteck- oder Schraubverbindungzu einer Säule,einem Schlauch, einer Kapillare oder dergleichen befestigt ist.
    [8] Vorrichtung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, dadurchgekennzeichnet, dass das Hohlfasersegment eine für Wasser durchlässige Membranbesitzt und an seinem verschlossenen oder verschließbaren Endedurch eine gasdurchlässige,für Wasserund wässrigeLösungenundurchlässigeporöseTrennschicht abgeschlossen wird.
    [9] Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,dass die gasdurchlässigehydrophobe poröseTrennschicht die Form einer Kapillarwand besitzt und konzentrischim Lumen des Hohlfasersegmentes angeordnet ist.
    [10] Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurchgekennzeichnet, dass das Anschlussstück oder der gasdurchlässige Verschluss einenAdapter zum Einleiten von Gas in das Lumen des Hohlfasersegmentesbesitzt.
    [11] Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurchgekennzeichnet, dass sie in eine Apparatur zum Parallelbetrieb mehrererChromatographiesäulenund mehrere Hohlfasersegmente integriert ist.
    [12] Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,dass sie eine Halterung fürdie Säulen mitzwei Abflusskanälenumfasst und einer dieser Abflusskanäle in einer bestimmten Positionder Säule miteinem einseitig verschlossenen Hohlfasersegment verbunden ist.
    [13] Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurchgekennzeichnet, dass das Bett jeder Chromatographie-Säule durcheine feinporige flüssigkeitsgesättigte Schichtabgeschlossen wird, die das Eindringen von Gas in das Bett bei derfür den Stromdes Elutionsmittels erforderlichen Druckdifferenz verhindert, undin die Säule über demBett ein Raum zum Auftragen der Probe oder des Laufmittels vorgesehenist.
    [14] Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet,dass mehrere oder zahlreiche Hohlfasersegmente an einen Mehrkanal-Verteilungsschalterangeschlossen sind und letzterer in jeder Stellung jeweils ein Hohlfasersegment mitder chromatographischen Fließstreckeverbindet.
    [15] Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,dass der Mehrkanal-Verteilungsschalterdurch ein Zeitprogramm oder Detektorsignale automatisch schaltbarist.
    [16] Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurchgekennzeichnet, dass jedes Hohlfasersegment sich in einem Fließkanal befindet.
    [17] Anwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis4 und einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 15 zum Sammeln undKonzentrieren chromatographisch getrennter Proben im Mikro- undHalbmikromaßstab.
    [18] Anwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis4 und einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 15 zur Probenvorbereitungin der Analytik.
    [19] Anwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis4 und einer Vorrichtung nach Anspruch 5 bis 15 zur Reinigung vonDNA aus Rohextrakten.
    类似技术:
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE102004030878B4|2008-05-08|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    2006-01-19| OP8| Request for examination as to paragraph 44 patent law|
    2006-01-19| OR8| Request for search as to paragraph 43 lit. 1 sentence 1 patent law|
    2006-11-23| 8105| Search report available|
    2008-11-06| 8364| No opposition during term of opposition|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    DE200410030878|DE102004030878B4|2004-06-25|2004-06-25|Verfahren zum selektiven Konzentrieren und Sammeln chromatographisch getrennter Stoffe und Sammelvorrichtung für die Flüssig-Chromatographie|DE200410030878| DE102004030878B4|2004-06-25|2004-06-25|Verfahren zum selektiven Konzentrieren und Sammeln chromatographisch getrennter Stoffe und Sammelvorrichtung für die Flüssig-Chromatographie|
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